中文
> 新闻中心

公司动态·行业动态


非洲猪瘟病毒通过液体或固体饲料的感染剂量(上)


非洲猪瘟病毒(ASFV)是一种传染性强,传播迅速的跨界动物疾病,也是全球猪肉产业的主要威胁。尽管基于植物的饲料已被确定是将病毒引入养猪场的潜在途径,但人们对饲料中ASFV传播的风险知之甚少。我们的目的是通过猪只的常规饮水和进食过程中的口腔接触来确定Georgia 2007 ASFV株的最低和中位感染剂量。

本篇文章主要讲述研究背景以及材料和方法,研究结果将在下篇文章中发布,请大家持续关注。

研究背景

ASFV引起的疾病的特征是严重的传播性出血,病死率几乎是100%。该病毒是非洲猪瘟病毒科家族的成员,是唯一已知的载体DNA病毒。室温下,ASFV在肉和血液中存活数月,并且耐温和pH极值。近期侵入中国和西伯利亚的ASFV分子特征表明,病毒分离株与Georgia 2007 ASFV株相似。疾病控制面临的挑战包括缺乏有效疫苗以及ASFV在野猪和蜱虫中存在流行的可能性。由于没有有效的疫苗和治疗方法,预防ASFV的传播是无疾病国家的首要目标。

在北美和欧洲,ASFV是猪肉产业的一种新兴威胁。历史性疫情,包括2007年ASFV侵入高加索地区并随后传播到俄罗斯,已被归因于喂养受污染的猪肉产品和直接接触猪群。此外,最近在罗马尼亚的一个大规模的生物安全性极高的农场报告了ASFV疫情,是来自多瑙河的污染水将ASF导入到约140,000头猪的养殖场。

自2013年猪流行性腹泻病毒进入美国以来,受污染的饲料作为将跨界动物疾病进入生物安全性极高的猪场的传播载体,已被认为是一个主要的风险因素。从猪流行性腹泻病毒中吸取的教训中人们意识到了饲料导入动物疾病所带来的风险。尽管如此,通过饲料或饲料原料传播ASFV风险的数据是有限的。

最近的研究表明,在模拟从东欧到美国的跨大西洋运输的条件下,ASFV在饲料原料如传统的豆粕,有机豆粕,豆饼和胆碱中有存活。这些报告表明,ASFV的传播可能归因于鲜为人知的传播途径,如饲料或水。

ASFV可以通过肌肉注射,口腔或直接接触这几种实验途径进行传播。然而,在许多关于口鼻传播的研究中,ASFV直接作用于口腔或扁桃体上。目前缺乏ASFV在植物性饲料和液体中感染剂量的研究;此外,关于ASFV Georgia 2007在饲料中的传播没有任何报道。尽管基于实地的流行病学报告提供了传播途径的信息,但它们提供的传染病剂量信息很少。因此,我们的目标是:
❶ 确定感染概率和剂量之间的关系;
❷ 确定导致ASFV感染≥1头猪所需的最小感染剂量(MID)或最低剂量;
❸ 确定中位感染剂量(ID50)或自然食用受ASFV Georgia 2007污染的饲料或液体时,50%的猪受ASFV感染所需剂量。

材料与方法

1.1 ASFV接种制备

在本研究中,我们使用了ASFV Georgia 2007/1分离株。在急性感染ASFV Georgia 2007时,从猪只收集的脾组织中产生病毒原种。切碎脾组织并在补充有青霉素/链霉素和杀菌素的磷酸盐缓冲溶液(PBS)存在下将其通过细胞过滤器。悬浮液以4000×g离心30min,并将上清液储存于4℃条件下。然后将沉淀重悬于含有抗生素和抗真菌剂的无菌PBS中,并通过3次冻融循环获得额外的病毒。将悬浮液离心,并将上清液储存于4℃条件下。

对于病毒滴定,通过使用3~5周龄猪的肺灌洗来收集猪肺泡巨噬细胞(PAM)。在含有10%胎牛血清和抗生素的RPMI培养基中,于37°C条件下在 5%CO2培养箱中培养PAMs 2d。然后一式三份制备10倍系列稀释的病毒,并将稀释液加入到96孔板中的PAM中。在37℃下培养3d后,用80%丙酮将细胞固定10min。使用1:6000稀释的p30单克隆抗体对细胞进行染色。然后将板于37℃温育1h并用PBS洗涤3次。使用1:400稀释的山羊抗小鼠抗体检测结合抗体,并在37℃温育1h。在倒置荧光显微镜下观察染色细胞,并根据Reed和Muench的方法计算每毫升log1050TCID50/mL组织培养感染剂量。

使用RPMI培养基稀释澄清的ASFV Georgia 2007脾匀浆,剂量范围从100TCID50 108TCID50,加入到终体积为100mL RPMI培养液或100g的配合饲料中。根据美国国家研究委员会对10-25kg猪的建议,该饲料是一种典型的基于玉米-豆粕型的基础日粮,配方营养充足。饮食中不含任何动物性饲料成分。为了将病毒与饲料混合,在500mL宽口高密度聚乙烯圆瓶中放入100g饲料,并用10mL病毒吸收30s,然后轻轻地用手滚动瓶子,使其均匀。

1.2 试验动物

研究中使用的猪和病毒是根据动物科学学会联合会关于农业动物在研究和教学中的护理和使用指南以及美国农业部动物福利法和动物福利法规进行的。该研究得到了堪萨斯州立大学机构动物护理和使用委员会以及机构生物安全委员会的批准。

我们从一个高健康的商业来源获得了84头杂交猪(51.8±2.2d)。将猪圈养在堪萨斯州立大学生物安全研究所的3个相同的66㎡房间中,并保持生物安全3级农业遏制条件。房间是环境控制的,每个房间完全交换空气14.5次/h。将猪单独维持在1.9㎡栏内,房间内每栏≥1.5m分隔开。不锈钢栏被抬高并包含开槽的玻璃纤维地板。栏的三面是实心的,第四面由栅栏和门组成。所有工作都是为了防止病毒的气溶胶扩散。阴性对照猪作为监测围栏之间交叉污染可能性的手段,喂养在室内。

1.3 实验设计

我们采用了以前关于猪繁殖与呼吸综合征病毒研究的实验设计和方法来确定ASFV Georgia 2007的中位感染剂量。液体组和饲料组均做7次重复实验,每次重复实验中,液体组和饲料组均使用6只猪。在液体组和饲料组的每个重复中,我们对5只猪给予特定剂量的ASFV;1只猪作为阴性对照。在整个实验过程中纳入了自适应研究设计,以最精确地估计ID50,同时从试验中获得最大化的信息。我们使用此信息来确定液体组103TCID50的初始感染剂量和饲料组104TCID50的初始感染剂量。完成第一次重复后,我们使用连续重新评估方法更新估算值。每个重复的结果用于选择后续重复的剂量;通常,在初始重复完成后,该过程导致液体剂量减少而饲料剂量增加。每种剂量的所有重复和猪数量如表1所示:

注:*显示5只感染猪的数据。在每个重复中,存在1只阴性对照猪。ASFV,非洲猪瘟病毒;TCID50,半数组织培养感染剂量;“-”没有猪进行测试,“+”每个重复中的一只猪在接种后5天内死于ASFV感染,在结果分析中被剔除。

对于饮水,给予猪混合有ASFV的100mL RPMI培养基。液体通过重力进料的限流乳头饮水器提供,该饮水器连接到可调节的镀锌壁架(管道1.3 cm×61cm)。如果猪只厌恶从乳头饮水,则将液体培养基放入一个小的不锈钢碗中供猪饮用。饲喂方面:在23cm不锈钢蠕动喂食器中给予猪混合有ASFV的100g配合饲料。通过终点滴定测定法(TCID50/mL)在PAM上返滴定每种病毒稀释液的感染滴度,以确认准确的剂量。阴性对照猪饲喂相同体积的无病毒培养液或全价饲料。

在接种ASFV前,先让猪只适应饮水器和喂食器3~4d。在此适应期间,在提供液体培养基或饲料之前,将水和饲料(饮用)或饲料(饲喂)保持10~14h。在饮水或进食过程中监测猪。一旦猪消耗了指定体积的液体或饲料,猪就可以不受限制地获取饲料和水,直到下一个保留期。适应后,每个重复中的5只猪提供含有特定剂量ASFV的相同底物,然后不受限制地获得饲料和水。

我们每天评估两次猪的ASF临床症状,并在接种后0和5d(dpi)从每只猪采集血液。在5dpi之前显示临床体征的猪被安乐死,并收集血液和组织。剩余的猪在5dpi时,进行安乐死和完整的尸检。我们根据血清或脾脏中ASFV的实时PCR检测来确定感染状态,并将脾脏中的病毒分离出来。如后文所述,我们构建了剂量 - 反应曲线并计算了ID50

1.4 检测指标

我们使用MagMAX-96病毒RNA分离试剂盒从血清或脾匀浆中提取核酸。我们根据King等人的研究进行了p72的PCR扩增。然后我们在CFX96实时系统上进行实时PCR分析,我们使用CFX96软件进行数据分析,并将结果报告为循环阈值。

1.5 数据分析

我们使用脾脏PCR,血清PCR和脾脏病毒分离这三种诊断方法评估了感染性,每只猪产生3个二元反应变量(即阳性或阴性)。当≥1个检测结果为阳性时,判断为ASFV感染。为了解释不完美的测试协议,我们同时分析了所有二元响应。

在没有假设剂量和感染概率之间关系的函数形式的情况下,我们使用约束样条回归模型。所使用的约束限于假设感染概率随着剂量增加而增加,并且该关系是连续的。基于3种诊断方法的结果,我们在贝叶斯分层模型中使用约束回归样条来估计单次暴露每种剂量的感染概率。在单次暴露的基础上,我们还模拟了重复暴露,假设重复暴露是独立事件。因此,我们计算多次暴露的感染概率为1– (1–p)q ,其中p是单次暴露感染概率,q是暴露次数。可以在线交互式查看重复暴露。我们通过使用R中的cgam包,使用先前描述的算法进行统计模型实施。

沪ICP备13039048号 2013-2015 上海优久生物科技有限公司 | 网站地图 |合作网站: 宁夏电视新闻网